Метод твёрдофазной адаптации клеток к тяжёлой воде
Прислано OlegMosin на September 30 2007 21:42:20
Разработан метод твёрдофазной адаптации к максимальной концентрации тяжёлой воды клеток микроорганизмов - продуцентов биологически активных соединений, различной таксономической принадлежности для направленного синтеза дейтерий-меченных соединений высокого уровня дейтерированности.


Расширенные новости
Разработан метод твёрдофазной адаптации к максимальной концентрации тяжёлой воды клеток микроорганизмов - продуцентов биологически активных соединений, различной таксономической принадлежности для направленного синтеза дейтерий-меченных соединений высокого уровня дейтерированности.

    Важной проблемой для направленного биосинтеза дейтерий-меченных соединений является адаптация клетки к тяжёлой воде. Долгое время считалось, что тяжёлая вода несовместима с жизнью. Известно, что высокие концентрации тяжёлой воды в ростовой среде могут вызвать ингибирование жизненно-важных функций роста и развития многих микроорганизмов [1]. Однако, несмотря на негативный биостатический эффект, оказываемый тяжёлой водой на клетки, некоторые бактерии устойчивы к высоким концентрациям тяжёлой воды в среде [2], в то время как растительные клетки могут нормально развиваться при концентрациях не более 50-75% тяжёлой воды [3], а клетки животных не более 35% тяжёлой воды [4].
    Мы задались вопросом - каков механизм клеточной адаптации к тяжёлой воде и могут ли клетки быть успешно адаптированы к росту и биосинтезу на средах с максимальными концентрациями тяжёлой воды? Для решения этого вопроса мы выбрали для экспериментов бактериальные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным таксономическим родам микроорганизмов, полученных из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:
1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент фенилаланина.
2. Methylobacillus flagellatum КТ, изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент лейцина.
3. Bacillus subtilis В-3157, полиауксотрофный по гистидину, тирозину, аденину и урацилу бациллярный штамм грамотрицательных бактерий, продуцент инозина.
4. Halobacterium halobium ЕТ 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин.

   Стартовым материалом для культивирования галофильных бактерий и бацилл служила дейтеро-биомасса метилотрофных бактерий, полученная в условиях многостадийной адаптации на твердых агаризованных средах (2% агар) с 2% дейтеро-метанолом, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды (от 0 до 98% тяжёлой воды). Полученную таким образом дейтеро-биомассу B. methylicum (выход составил 100 г по влажному весу с 1 л. среды) автоклавировали в 0.5 н. растворе дейтерохлорной кислоты (в тяжёлой воде) (08 ати, 30 мин), нейтрализовали 0.1 н. КОН (рН 7.0) и использовали далее в качестве источника субстрата для адаптации и культивирования бацилл и галофильных бактерий.
   Культивировании клеток микроорганизмов проводили на трёх питательных средах (количества компонентов приведены в г/л):
1. Минимальная среда М9 для роста метилотрофных бактерий, на основе различных концентраций тяжёлой воды и добавками 0.5-2% метанола (в зависимости от физиологической потребности бактерий) или дейтеро-метанола: KH2PO4 3; Na2HPO4 6; NaCl 0.5; NH4Cl 1.
2. Гидролизная среда 1 (ГС1) для культивирования бацилл (на основе 99.9% тяжёлой воды): глюкоза 120; (2Н)меченая биомасса B. methylicum 25; NH4NO3 30; MgSO4 x 7H2O 20; мел 20.
3. Гидролизная среда 2 (ГС2) для культивирования галофильных бактерий (на основе 99.9% тяжёлой воды): NaCl 250; MgSO4 x 7H2O 20; KCl 2; CaCl2 x 6H2O 0.065; цитрат натрия 0.5; дейтеро-меченая биомасса B. methylicum 20.
   Культивирование метилотрофных бактерий и бацилл проводили при 370 С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях аэрации по методикам [5-6], используя в качестве источников дейтерия тяжёлую воду и дейтеро-метанол. Культивирование галофильных бактерий проводили на тяжеловодородной среде при освещении лампами дневного света ЛБ-40.
Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации тяжёлой воды в ростовых средах в присутствии 0.5-1%-ного метанола/дейтеро-метанола , так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к дейтерию будет оказывать благоприятный эффект на параметры роста и общее самочувствие клеток. Предложенный нами метод твёрдофазной адаптации состоит из серии множественных адаптационных пассажей исходной культуры на чашках Петри с твёрдыми агаризованными средами с 2% дейтеро-метанолом при ступенчатом увеличении концентрации тяжёлой воды в них (от 0 до 98% тяжёлой воды). При этом на чашках Петри последовательно отбирались отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих низкие концентрации тяжёлой воды. Затем их пересевали на среды с большей степенью дейтерированности, включая среду с 98% тяжёлой водой (степень выживаемости бактерий на максимальной тяжёловодородной среде составила не более 50%). За ходом адаптации клеток наблюдали по изменениям продолжительности лаг-фазы, времени клеточной генерации и выходов микробной биомассы, а также по максимальному уровню накопления конечных продуктов биосинтеза в культуральной жидкости. Рост бактерий оценивали по способности к образованию отдельных колоний на поверхности твёрдых агаризованных сред, а также по величине оптической плотности суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 (США) при 540 нм.


Литература:
1. Crespi H. L. Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins. in: Synt. and Appl. of Isot. Label. Compd. // Ed. R. R. Muccino. - Elsevier. - Amsterdam, 1986 - P. 111-112.
2. Katz J, Crespi H.L. // Pure Appl. Chem. - 1972. - V.32. - P. 221-250.
3. Daboll H. F., Crespi H. L., Katz J. J. // Biotechnology and Bioengineering. - 1962. - V. 4. - P. 281-297.
4. Crespy H. L. Stable Isotopes in the Life Sciences. - International atomic energy agency. - Vienna. -1977. - P. 111-121.
5. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 3. - С. 3-12.
6. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. // Биоорганическая химия. - 1996. - Т.